10.1 Fremstilling af kromosom præparater

Lektion 10

Der beskrives simple metoder til fremstilling af kromosompræparater, og normal karyotypen beskrives for alle vore husdyr. Karyotypen går fra minkens 30 til hundens 78 kromosomer. Minken har flest meta- og submetacentriske og hunden næsten kun acrocentriske kromosomer. Der gives en opsummering af de mest almindelige kromosomfejl hos husdyr, og metoder til at påvise dem. Der bliver omtalt flow-cytometri af sæd, hvor sædcellerne kan opdeles i to populationer - en der har Y-kromosomet og en der har X-kromosomet. Spermatozoer fra translokationsdyr vil udvise flere end de to populationer.
-----

Det er kun under cellens metafase, at kromosomerne bliver synlige og egnede for den klassiske kromosomanalyse. Da metafasen er meget kortvarig, er det nødvendigt at have celler i stærk vækst for at kunne fremstille kromosompræparater.

Dyrkning af lymfocytter er den mest anvendte metode til at få mange celler i metafase. Lymfocytterne er normalt inaktive celler, og cellerne skal derfor stimuleres for at dele sig. Det mest almindelige anvendte mitogen (mitosestimulator) er PHA (phytohaemagglutinin), der er en ekstrakt fra bønner.

Følgende procedure anvendes for 'blod' kultur:

• der anvendes heparinstabiliseret blod, der kan stå ved stuetemperatur i op til 5 dage
• 0,3-0,5 ml fuldblod i 5 ml vækstmedium (RPMI) tilsat fetal kalveserum og PHA dyrkes i 60 timer ved 38 grader
• de sidste 2 timer med tilsat colcemid (derefter centrifugering og afpipettering af supernatant)
• cellerne behandles 10 min. i halv fysiologisk saltopløsning (0,075M KCl) --- do
• derefter 15 min. i fiks. (metanol iseddike 3:1) ------------------- do
• vask, ny fiks 3 gange ----------------------------------- do
• opbevares i fiks. ved minus 20 grader
• drop cellesuspension på objektglas og lufttørring
• farvning med Giemsa el. andet kernefarvestof
• fotografering

Kromosomer kan også fremstilles fra fibroblast celle kulturer, der feks. kan etableres fra et øreklip eller subcutan muskelvæv. Kulturen skal etableres inden for det første døgn efter prøvens udtagning. Cellekulturen skal vokse omkring 2 uger før der er tilstrækkelig mange celler til fremstilling af kromosompræperater. Dyrkningsmedierne kromosom præperationsmetoderne er de samme som nævnt under 'blod' kultur, men der skal dog ikke anvendes PHA.

For at identificere de enkelte kromosomer anvendes båndfarvning. Dette gøres ved at dyrke cellerne de sidste 6-7 timer (afhængig af væksthastighed) før høst med tilsætning af en tymidin analog Brom-deoxy-Urasil (BrdU). Ved farvning med Acridin orange vil BrdU inkorporation give matte bånd i de områder, der replikerer sent (efter tilsætningen af BrdU), hvorimod de tidligt replikerende områder giver en kraftig farve. Ved hjælp af denne farvning kan demonstreres inaktivering af et af hunnens X-kromosomer, idet det inaktiverede X-kromosom har ekstrem sen replikation, se lektion 2.2

Næste side