12.5 Påvisning af DNA-markør koblet til sygdomsgener eller QTL'er

Foregående side

Påvisning af DNA-markør generelt
Hos pattedyr og fugle er størrelsen af det samlede genom ca. 3000 centi Morgan (cM) eller rekombinationsenheder, der er dog en betydelig variation mellem arter. De største kromosomer er to til tre hundrede cM lange, mens de mindste er under 100 cM lange. Her er der også betydelig forskel mellem de enkelte arter, hvor mink kun har 15 kromosompar og hunden har 39. Hos pattedyr er der forskel på rekombinationshyppigheden mellem hanner og hunner, det er således, at hunnerne har højere (10 to 20 %) rekombinationshyppighed end hannerne, hvilket især gør sig gældende i områderne omkring centromerene.
Tæt kobling er lettere at påvise end løs kobling, afstande over 30 cM er i praksis næsten umulige at påvise idet det kræver et meget stort antal informative individer (500-1000). Det er således, at kobling indenfor 10 cM kan påvises på grundlag af under 50 informative stk afkom fra en analysekrydsning.
For at man kan dække genomet regnes der med, at der skal anvendes en DNA-markør for hver 20 cM, dette giver ialt 150 DNA-markører, der skal types for at dække hele genomet.
For at DNA-markøren kan anvendes skal den være informativ, dette er for de fleste DNA-markører kun tilfældet i 50-70 procent af familierne, der skal analyseres. For at få et komplet set af DNA-markører, må det derfor prescreenes hos forældredyrene med op til 300 markører, for at få et brugbart sæt på 150 til analyse af en given familie.

Egnet familiemateriale til påvisning af sygdomsgen
Udspaltning af et sjældent forekommende recessivt sygdomsgen sker normalt i forbindelse med indavl i forholdet 1 til 3. Den statistisk mest optimale situation er en 1 til 1 udspaltning, men det kan normalt ikke skaffes ved recessive sygdomsgener, men man kan nøjes med at type lige så mange raske individer som syge for at få de mest optimale analyse betingelser.
For at finder frem til sygdomsgenet skal man regne med typning af ca 10 forældre dyr der er anlægsbærere mere end 20 stk afkom, hvoraf de 10 har sygdommen. Man starter med typning af markør 1, derefter udføres en statistisk analyse. Man fortsætter med typninger af det næste markørgen indtil man finder koblingen. Man kan finde den koblede allel ved først DNA-markør, eller man kan finde den ved markør nr 150, men man skal i gennemsnit anvende 75 markører før man når frem til det koblede gen. Den statistisk signifikante association vil da se således ud: 

                      syg             ikke syg
           Genotype ------------------------------------  
	   AA	     |	 10	 	3 	 |  13
	   ikke AA   |	 4	        13 	 |  17
	            ------------------------------------ 
	             | 	14		16	 |  30

Hvor der er nogle få rekombinanter, 3 med genotypen AA der ikke er syge, og 4 der er syge, der ikke har genotypen AA.
Opsummering: Skal man finde frem til en DNA-markør skal man have et dyremateriale indenfor en eller to familier, hvor man har information mindst 20 stk afkom, hvoraf mindst 10 er syge. For arter hvor der findes en markør chip, anvendes denne naturligvis da det det er både hurtiger og billiger, man kan også nøjes med færre dyr da der på chippen er flere markører for hver centi Morgan, så det kan påregnes, at der er markører der har 0 rekombinanter.
Når man har fundet frem til en koblet markør er det naturligt at gå videre med markører, der ligger imellem de to markører der gav kobling, da det ultimative mål altid vil være at nå frem til det egentlige sygdomsgen. Så snart man har fundet et koblet gen vil sammenlignende studier med andre arter også kunne begynde, der tænkes her på at finde kandidatgener for sygdommen i de korresponderende kromosomområder.
Alternativt til den klassiske DNA-markør analyse kunne være at man ved studie af sygdommen og sammenligning med andre arter havde et kandidatgen. Et kandidatgen er et gen som har en rimelig chance for at være skyld i sygdommen, når der er foretaget en vurdering af sygdommens ætiologi. Har man et eller flere kandidatgen startes der med at type for disse. Er det rigtige kandidatgen vil man finde fuldstændig association, omvendt kan fuldstændig association ikke give det endelige bevis på at kandidatgenet er sygdomsgenet.

DNA-markører anvendt til QTL studier
DNA-markører for quantitative trait loci (QTL) kræver langt større datamaterialer end for at finde en DNA-markør for et sygdomsgen, såfremt genet skal påvises i en normalt udavlet population. QTL'er svarer til de loci, der er omtalt under definitionen af avlsværdi i lektion 6. De fremherskende problemer ved påvisning af et QTL er endvidere, at man ikke ved om der er et der spalter ud i en given familie. Og man ved heller ikke på nogen måde, hvor stor effekten i givet fald skal være på en given egenskab. Der er yderligere det problem, at når man først har påvist en QTL, kan man ikke på nogen måde være sikker på, at effekten skyldes et gen, da man ikke umiddelbart kan skelne den fra to koblede gener med hver sin effekt på den givne egenskab.
Planlægning af et QTL studier er en sag der skal gøres meget omhyggeligt, for at man kan forvente at nå frem til et fornuftigt resultat. Da man skal type mange dyr for at estimerer en given QTL tilstrækkeligt præcis til at den kan få praktisk betydning, og der bør gennemføres statistisk power beregninger for at finde frem til hvor mange dyr der skal types for at finde en given effekt. Det er tillige vigtigt at typningerne kan anvendes til at evaluere så mange egenskaber som muligt. Så når man starter med at planlægge et QTL studie er det vigtigt at få målt så mange egenskaber som muligt på de pågældende dyr. Her kan nævnes alle mulige mål for produktion, mål for sygdomsforekomst og andre observerbare egenskaber. Antallet af DNA-markører, der skal anvendes, svarer dog til de ca. 150, som blev nævnt under afsnittet om påvisning af DNA-markør for sygdomsgen.
Alternativt til studier af QTL'er i normalpopulationer kan være at anvende studie af F2 individer fra specielle eksotiske krydsninger som feks. mellem tamsvin og vildsvin. Sådanne fundne QTL'er vil imidlertid ikke umiddelbart kunne anvendes i forbindelse med det normale avlsarbejde. Sådanne påviste QTL'er kan imidlertid anvendes i forbindelse med udpegning af kandidatgener, der kan bidrage til en dybere forståelse af de almindelige fysiologiske funktioner.

Sire og grandsire design til påvisning af QTL'er
Grand sire designet har været anvendt en hel del indenfor studie af kvægpopulationer. Det gå ud på at man kun typer tyrene, idet man udvælger tyre der har et større antal sønner. Man opdeler da sønnerne i to klasser dem der har fået et bestemt gen fra faderen og dem der har fået det andet. Man kan så danne en statistisk kontrast mellem middel avlsværdien af de to klasser, dem med eller uden genet fra grand sire. Dette kan gøres for alle DNA-markører og der er pt. fundet frem til QTL'er for fedt % og mælkeydelse i amerikanske bestande af Holstein Frisian, men QTL'erne har endnu ikke været anvendt i praktisk avlsarbejde.
Fordelen ved grand sire designet er, at der skal types forholdsvis få individer og man har en 1 til 1 udspaltning blandt afkommet, men en af begrænsningerne er, at der kun kan estimeres additive effekter, hvilket er tilfældet i sire designet.
Sire designet; her types alle individer der måles såvel som forældre dyrene. Men da DNA-markørerne er mest interessante for egenskaber med lav heritabilitet skal der types mange dyr for at få et rimeligt præcist skøn for effekterne. Man får her alle tre genotype klasser blandt afkom med 1:2:1 udspaltning.
Variansen på en geneffekt (middelværdi) er omvendt proportional med antallet, på hvilket geneffekten er baseret. En kontrast mellem to effekter kan i princippet evalueres med et t-test, her er det også den middelværdi der er baseret på færrest antal der bestemmer hvor stærk testet er.

Nedenstående er vist en tabel med mindste signifikante forskelle. Forskellene er påvist i en population med middel sygdomsfrekvens på 10 %. Syg ikke syg er binominalfordelt med variansen 0,1*0,9/N hvor antallet er testede dyr i en klasse. S.D. er beregnet som sqrt(0,1*0,9/N + 0,1*0,9/N) og t = dif/S.D. og anvendelse af 5% signifikansgrænser.

Antal A1 Antal A2 S.D. Mindste signifikante differens i sygdomsfrekvens
5000 5000 0,00600 1,8 % enheder
500 500 0,0190 5,7 % enheder
100 100 0,0420 12,6 % enheder

For f.eks. at kunne påvise en forskel i sygdomsforekomst på 10 procent enheder, skal der være ca 200 dyr i hver genotype gruppe, hvoraf de dyr der har fået A3 er der 5 % syge og de dyr der har fået A4 er der 15 % syge. Tabellen refererer til parringstyperne vist nedenstående, der viser de to design med A1A2 som spalter ud i grand sire designet, A3A4 som spalter ud i sire designet. Ligger QTL'en midt mellem A og B locus som vist, skal man få signifikant effekt i begge markørsystemer, såfremt der er nogen.

Figur 12.2. Viser de to klassiske design sire og grand sire til påvisning af QTL'er med test af afkom for markørgen og fænotype måling. Contrasterne kan sammenlignes med t-test.

I figur 12.2 er vist de to klassiske design. Der er en grandsire med genotypen A1A2 i et lokus. Tyren har 20 sønner der types, der er 10 sønner der har fået A1 markøren og 10 der har fået A2 markøren. Der regnes gennemsnit for en egenskab for alt afkom efter A1 sønnerne og tilsvarende for alt afkom efter A2 sønnerne. Forskellen mellem disse to tal kaldes en kontrast. I grand sire designet kommer genotypedata fra fædrene og phenotypedata fra deres afkom.
I sire designet kommer phenotypedata og genotypedata fra de samme dyr. Sire designet er vist i højre side af grafen. kontrasterne der er vist er de samme som for grandsire designet, men der kan også dannes kontraster mellem f.eks genotyperne A2A3 og A2A4 osv.

Næste side